屎肠球菌透明质酸酶全长基因的克隆表达和免疫原性

    该项研究目的是构建屎肠球菌透明质酸酶（hyaluronidase，hyl）基因重组表达质粒，在大肠埃希菌中表达获得重组蛋白，探讨Hy1蛋白经口服免疫小鼠后，机体产生的免疫应答。方法采用PCR扩增hyl基因片段，克隆至pQE-30质粒上，构建重组质粒pQE-hyl，转化E，coli DH5α，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白Hy1；Western印迹分析其免疫反应性。融合蛋白经镍离子柱纯化后，Hy1和屎肠球菌全菌蛋白TX0016分别给小鼠灌胃进行免疫，ELISA法检测小鼠血清IgG、IgA、小肠黏液sIgA和粪便sIgA。用TX0016进行腹腔攻击已免疫的小鼠，观察其免疫保护性。结果经测序hyl基因全长1662bp，为编码553个氨基酸残基的多肽。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS―PAGE）分析相对分子质量约为60000。可溶性表达占全菌的38％以上，经亲和层析后可获得纯度为92％以上的重组蛋白。Western印迹证实了其免疫反应性。灌胃免疫小鼠后，ELISA法检测结果Hy1组血清IgA、IgG、粪sIgA、肠黏液sIgA分别为0．365±0．048、0，431±0，064、0．743±0，056和1．112±0．113，对照组则分别为0，051±0．013、0．098±0．019、0．102±0，032和0，187±0，051，差异有统计学意义（P〈0．01）。用半数致死量（I，D50）的细菌量攻击后，Hy1免疫组小鼠的存活率为70％，而对照组为50％。由此得出结论融合蛋白Hy1经口服免疫可有效诱导黏膜免疫应答，产生高水平的sIgA，发挥局部黏膜免疫作用。/**/