中国研究者用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究

6月25日消息，中国研究者研制了羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAT）纳米粒，评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性。

研究者用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体。经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验，了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用；用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性；用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3（neurotrophin 3，NB）体外转染实验（绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法）及NB的蛋白印迹分析，观察HAT介导的NB基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况；经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）质粒载体-NT3基因复合物（HAT—pEGFPC2-NT3），用免疫组化（二氨基联苯胺法）观察NT3在耳蜗的表达，以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力。

结果发现含量250．0μg／ml，pH值3～7是这种长约40～50nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境，并可有效保护基因不被核酸酶（DNase Ⅰ）破坏。四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62．5μg／ml至500．0μg／ml4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响，细胞形态无变化。EGFP荧光显微镜观察显示，HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15．7％±2．6％（-↑x±s）；将HAT—pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元，也可见明显的EGFP表达。NT3免疫组化显示，向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3，可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。

由此，研究者得出结论，HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染，而且可介导其耳蜗活体转染；尽管转染率有待提高，但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁，仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体。