荧光定量PCR检测不孕不育患者解脲支原体和沙眼衣原体

李传杰  梁金 （广西医科大学第七附属医院  广西 梧州  543001）

【摘要】 目的  了解不孕不育患者解脲支原体(UU)和沙眼衣原体(CT)感染情况，探讨荧光定量PCR(FQ—PCR)应用于诊治不孕不育的意义。方法  采用FQ—PCR方法检测不孕不育患者宫颈分泌物、精液或前列腺液标本中的UU-DNA和CT-DNA含量。结果  116例不孕不育患者中有62例感染UU或CT（感染率53.4%），UU和CT的感染率分别为42.2%和17.2%，混合感染率6.0%；男性UU和CT感染率分别为35.9%和21.9%，女性UU和CT感染率分别为50.0%和11.5%；女性患者UU和CT的基因拷贝数均高于男性。结论  UU和CT是引起男女不孕不育的重要原因，UU感染率明显高于CT；FQ—PCR技术应用于诊治UU或CT泌尿生殖道感染引起的不孕不育简便、快捷、安全、可靠。
【关键词】 不孕不育  荧光定量PCR  解脲支原体  沙眼衣原体
To testing Ureaplasma Urealyticum and Chlamydi Trachonmatis of the infecund and the can not bear patients using FQ-PCR.LI Chuan-jie,LIANG JinThe 7th affiliate hospital of Medicine University of Guang Xi, Wuzhou，Guang Xi，543001  China
【Abstract】  Objective  To find out the station of the infecund and the can not bear patients were infected by UU and CT and discuss the meaning of diagnose infecund and can not bear using FQ-PCR. Methods  Measure content of UU-DNA and CT-DNA in the secretion of uterine’s cervix，the exudates of ejaculate，prostate of the infecund and the can not bear patients using FQ-PCR. Results  There are 62 patients infected by UU or CT in all of 116 infecund and the can not bear patients(the infections rate is 53.4%). The rate of infected by UU is 42.25. the rate of infected by CT is 17.2%. The rate of infected by both UU,CT is 6.0%. Man’s rate of infected by UU ,CT is 35.9%,21.9%. Woman’s rate of infected by UU ,CT is 50.0%,11.5%. For UU’ s and CT’ s gene copy femate more than mate.  Conclusion  Infected by UU and CT is the reason causing infecund and the can not bear. UU’s infections rate is more than CT’s. FQ-PCR is a mean use to diagnose infecund and the can not bear for Genital infection by UU or CT.
【Key words】  The infecund and the can not bear patients; FQ-PCR; Ureaplasma Urealyticum; Chlamydi Trachonmatis
 
　　随着社会的发展，不孕不育症患者不断增多，使之不仅是一个医学问题，同时也成为一个社会问题。研究表明，衣原体、支原体的泌尿生殖系感染是造成男女不孕不育的因素之一。为了解我国不孕不育患者泌尿生殖道解脲支原体（UU）和沙眼衣原体（CT）的感染情况，我们采用荧光定量PCR(FQ—PCR)方法对116例不孕不育患者宫颈分泌物、精液或前列腺液标本的CT-DNA和UU-DNA含量进行了检测，现报告如下。

1 资料与方法
　　1.1 病例选择  选择116例2003年5月至2005年5月就诊于我院泌尿外科和妇产科、结婚2年以上、夫妇性生活正常、未避孕而无子女的患者，其中男性64例，女性52例，年龄20～45岁，平均29.6岁。女性患者妇检输卵管通畅，月经周期基本正常。另选同期门诊有正常生育能力的对照组60例，其中男性28例，女性32例，年龄23～37岁，平均28.7岁。
　　1.2 标本采集  女性患者采取截石位用窥阴器充分暴露子宫颈，以棉拭子拭去子宫颈口的分泌物后，将无菌棉拭子插入宫颈口1~2 cm处，旋转1周，停留10~20 s，取出置含1 ml生理盐水的无菌试管内震荡洗涤。男性患者则用以无菌棉拭子从精液或前列腺液中略捻少许置含1 ml生理盐水的无菌试管内震荡洗涤。
　　1.3 仪器和试剂  采用美国ABI公司的Gene Amp 5700自动荧光定量PCR仪；UU和CT的FQ—PCR试剂均为广州中山大学达安基因诊断中心产品。
　　1.4 实验方法  标本洗涤液12 000 rpm离心5 min，去上清液，用碱裂解法提取UU和CT的DNA置ABI—Gene Amp 5700扩增。即：首先93℃ 2 min预变性；其次按93℃ 45 s，55℃ 60s做10个循环；然后按93℃ 30 s，55℃ 45 s做30个循环；最后由仪器自动分析计算出定量结果，Ct值＜30，则实验结果为阳性。
　　1.5 统计方法  不孕不育患者UU和CT感染率与正常对照组的资料对比采用X2检验，女性和男性UU或CT感染者基因拷贝数的差异采用样本均数的t检验。

2 结果
　　116例不孕不育患者中有62例的受检标本检测出 UU或CT，检出率（53.4%）与正常对照组（11.6%）差异显著（P＜0.01），其中：UU—DNA阳性49例，CT—DNA阳性20例，UU和CT混合感染（UU+CT阳性）7例；男性UU和CT感染率分别为35.9%和21.9%，女性UU和CT感染率分别为50.0%和11.5%；女性患者感染UU和CT的基因拷贝数均明显高于男性（P＜0.05，P＜0.05），见表1。

 
3 讨论  
　　3.1 不孕不育与泌尿生殖系UU和CT感染的关系  泌尿生殖系统感染UU和D-K型CT后引起局部炎症反应及一系列病理改变导致尿道炎、附睾炎、前列腺炎、阴道炎、子宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎等泌尿生殖系疾病[1,2]。男性泌尿生殖系感染UU后UU吸附在精子表面影响精子的正常功能使精子运动能力降低、数目减少和畸型精子增多，以及前列腺或附睾等器官感染CT后精浆的生理功能受到影响均可引发男子不孕不育；UU或CT感染引起的输卵管粘细胞炎性病变可使输卵管粘连、管腔变窄、阻塞导致卵子或受精卵通道障碍，子宫内膜炎则干扰受精卵着床、植入及早期胚胎发育；贺惠琼等认为UU引起女性不育的主要原因是子宫内膜的慢性炎症，感染诱发的变态反应和自身免疫等亦是可能因素[3]。近年的文献报道不孕不育患者泌尿生殖系统的UU和CT感染率分别达到35.5%~48.5%和22.0%~46.5% [2-4]。本组资料116例不孕不育患者中UU—DNA阳性率42.2%，CT—DNA阳性率17.2%，UU或CT的总检出率达53.4%，而正常对照组则分别为8.3%、5.0%和11.6%，说明泌尿生殖系统UU和CT感染仍是不孕不育的重要原因，感染性不孕症患者中UU的感染率明显高于CT；UU—DNA阳性率与文献报道基本一致，CT—DNA阳性率偏低，UU、CT混合感染（6.0%）则明显低于祝文峰等报道的18.3%[2-4]，这可能与本地区前些年的诊断水平、诊疗习惯引起的病原体耐性变迁、或生活习俗等因素有关。
　　3.2 FQ—PCR定量检测应用于不孕不育患者的临床意义  本文采用的FQ—PCR利用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增技术直接发挥DNA探针杂交作用，高度敏感的荧光信号使定量检测范围达0-1011个基因拷贝数/ml，完全密封式操作极大地降低了PCR产物污染造成的假阳性，检测过程省去扩增产物的后处理和仪器对PCR扩增产物的自动分析 [5]既节省时间又减少了传统PCR目测结果的主观误差。 本组研究资料显示患者宫颈分泌物、精液或前列腺液标本中的UU-DNA和CT-DNA定量的精度和范围分别到达1.7×103～3.1×108/ml和1.8×103～6.7×107/ml，说明FQ—PCR定量结果能够客观、适时地反映患者的病情，这无论是对于典型的UU和CT感染，还是病程隐匿、临床表现轻微或无症状的感染，均在疾病的早期发现、早期诊断、疗效观察和判断预后等方面有重要意义。
　　3.3 女性患者UU和CT感染率明显高于男性的原因分析  研究资料中不孕不育患者女性感染UU和CT的基因拷贝数均明显高于男性则可能与感染灶病理性质和标本采样方法等因素有关。即：女性宫颈分泌物标本因炎症病灶组织受累细胞较多、宫颈分泌物标本采集处（2~4 cm）以易受病原体侵袭而且易于刮落的柱状上皮细胞为主，所以标本中病原体含量相对较多；男性标本的采集大多为精液或前列腺液排经病灶部位时“冲刷”带出病原体或受累细胞，其病原体含量则相对较少，故临床上行泌尿生殖系UU和CT的FQ—PCR检测时应高度重视标本的采集环节，综合分析检测结果的临床意义。

参考文献
[1]  叶顺章，张木有. 现代性传播疾病实验室诊断技术[M]. 广州：广东科技出版社，1999：44-58.
[2]  李建蓉，吴南屏，吴灵娇. 不孕不育患者几种病原感染的检测[J].中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：109.
[3]  贺惠琼，周月映，宋淑珍. 92对不孕不育患者沙眼衣原体、解脲支原体检测结果分析[J].中国计划生育学杂志，2002，10（9）：554-555.
[4]  祝文峰，黄志锋，胡红波，等. 荧光定量PCR在不孕证宫颈沙眼衣原体和解脲支原体检测中临床意义[J].中国现代医学杂志，2001，11（9）：70-72.
[5]  Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Reol quantitative PCR[J]. Genome Res，1996，6(10): 986-994.