血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞增殖的影响

崔  焱 马雪梅 龚 浩 (首都医科大学附属北京友谊医院 北京  100050）

【摘要】 目的  观察血管紧张素Ⅱ对体外培养的肝星状细胞（HSC）增殖的影响。方法  采用HSC-T6肝星状细胞系作为活化的肝星状细胞的研究模型。采用噻唑蓝比色法检测肝星状细胞的增殖。采用3H标记胸腺嘧啶掺入法检测肝星状细胞DNA的含量。结果  血管紧张素Ⅱ(1Í10–10~1Í10–4 mol/L)各浓度组OD450值，均显著高于对照组(P<0.05)。血管紧张素Ⅱ(1Í10–10~1Í10–4 mol/L)各浓度组3H-TDR掺入量cpm值，均显著高于对照组(P<0.05)。结论  血管紧张素Ⅱ能够剂量依赖性地促进肝星状细胞增殖和DNA的合成。
【关键词】 血管紧张素Ⅱ  肝星状细胞  增殖
Effect of angiotensinⅡon proliferation of hepatic stellate cells .CUI Yan,MA Xue-mei,GONG Hao. Beijing Friendship Hospital Affiliate of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050  China;
【Abstract】  Objective  To investigate the effect of angiotensinⅡon the proliferation of in vitro cultured hepatic stellate cells.  Methods  HSC-T6 rat hepatic stellate cell line was chosen as the study model of the activated hepatic stellate cells. MTT colorimetric assay was used to evaluate the proliferation of HSCs. HSC DNA synthesis was evaluated by way of 3H-thymidine incorporation.  Results  OD450 value of angiotensinⅡgroups at concentration from 1Í10–10mol/L to 1Í10–4mol/L, was higher than that of control group(P＜0.05). Cpm value of angiotensinⅡgroups at concentration from 1Í10–10mol/L to 1Í10–4mol/L, was higher than that of control group(P＜0.05).  Conclusion  AngiotensinⅡ can increase the proliferation and DNA synthesis of hepatic stellate cells dose-dependently.
【Key words】AngiotensinⅡ; Hepatic stellate cell;  Proliferation
 
　　肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）受到致病因子的刺激而活化过渡到肌成纤维细胞（myofibroblast, MFB）进而成为活化的肝星状细胞，这一过程称为肝星状细胞的激活。肝星状细胞激活是肝纤维化发生发展的中心环节。活化的肝星状细胞表现为细胞增殖明显。
本实验针对外源性的血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）对体外培养的活化肝星状细胞的促增殖作用展开研究。

1 材料与方法
　　1.1 材料
　　HSC-T6肝星状细胞系，由美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授惠赠。血管紧张素Ⅱ为美国Sigma公司产品；DMEM（高糖型）、胎牛血清为美国Gibco公司产品；噻唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品；3H标记胸腺嘧啶（3H-TDR）为英国Amersham Pharmacia Biotech公司产品，比活性1.0 mCi/ml。
　　1.2 主要仪器
　　美国Corning公司25cm2细胞培养瓶、 96孔细胞培养板；日本SANYO公司MCO-15A二氧化碳恒温培养箱；美国Molecular Devices公司SPECTRA MAX 250 酶标仪；美国Beckman公司LS 6500液闪计数仪。
　　1.3 实验分组
　　将96孔细胞培养板中的HSC-T6肝星状细胞随机分为8组：1组：对照组；2组：AngⅡ1Í10–10 mol/L组；3组：AngⅡ1Í10–9 mol/L组；4组：1Í10–8 mol/L组；5组：1Í10–7 mol/L组；6组：1Í10–6 mol/L组；7组：1Í10–5 mol/L组；8组：1Í10–4 mol/L　　　　组。组
均设3孔重复。
　　1.4 噻唑蓝比色法检测肝星状细胞的增殖[1]
　　取对数生长期的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM细胞培养液制成5×103个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μl，37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后换液。对照组换不含药物的培养液，实验组换含不同浓度药物的培养液，每组设3孔重复。
　　37℃、5%CO2条件下培养48 h，弃上清，每孔加入200 µl新鲜配制的含0.05% MTT的无血清培养液，继续培养4 h，弃上清，加入200 µl二甲基亚砜（DMSO）将MTT甲替沉淀充分溶解，然后在酶标仪上测定450 nm处的光密度值。
　　1.5 3H标记胸腺嘧啶掺入法检测肝星状细胞DNA含量[2, 3]
　　取对数生长期的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM细胞培养液制成5×103个/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μl，37℃，5%CO2条件下培养，待细胞贴壁后换液。对照组换不含药物的培养液，实验组换含不同浓度药物的培养液，每组设3孔重复。
　　37℃、5%CO2条件下培养48 h，将2 µCi/100 µl的3H-TDR加入细胞继续培养12 h后弃去培养液，用0.125%胰蛋白酶消化，D-Hanks液漂洗，5 000转/分钟离心5 min后，弃上清，转入甲苯闪烁液中，用液闪计数仪测定Cpm值。
　　1.6 统计学处理
　　采用SPSS for Windows 统计软件对数据进行分析处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，各组间均数的两两比较采用Student-Newman-Keuls法，P＜0.05认为差异有显著性意义。

2 结果
　　2.1 MTT比色法检测血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞增殖影响
　　MTT比色法检测血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞增殖影响的结果见表1。

　　　　　　

　　以450 nm处的光密度值（OD450）反映活细胞的数目，即肝星状细胞的增殖。结果表明，血管紧张素Ⅱ从1Í10―10 mol/L到1Í10―4 mol/L，各浓度组的OD450值比较对照组均明显增加（P<0.05），除1Í10―7 mol/L和1Í10―6 mol/L两组间比较差异无显著性外（P＞0.05），其余各组之间两两比较差异均有显著性（P<0.05）。说明在一定浓度（1Í10－10～1Í10－4 mol/L）范围内，血管紧张素Ⅱ能够促进肝星状细胞的增殖，而且随着血管紧张素Ⅱ浓度的增加，肝星状细胞的增殖更加明显，即呈剂量依赖性。
　　2.2 3H-TDR掺入法检测血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞DNA合成影响
　　3H-TDR掺入法检测血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞DNA合成影响的结果见表2。

　　　　　　

　　以3H-TDR掺入量（cpm值）代表细胞内DNA的含量，反应肝星状细胞增殖的状态。结果表明，血管紧张素Ⅱ从1Í10―10mol/L到1Í10―4mol/L，各浓度组的3H-TDR掺入量比较对照组均明显增加（P<0.05），除1Í10―10mol/L和1Í10―9mol/L、1Í10―7mol/L和1Í10―6mol/L组间比较差异无显著性外（P＞0.05），其余各组之间两两比较差异均有显著性（P<0.05）。说明在一定浓度（1Í10－10~1Í10－4 mol/L）范围内，血管紧张素Ⅱ能够促进肝星状细胞DNA的合成，肝星状细胞增殖活跃，而且随着血管紧张素Ⅱ浓度的增加，肝星状细胞DNA的含量明显增加，即呈剂量依赖性。

3 讨论
　　HSC-T6肝星状细胞系是由SV40转染SD大鼠肝星状细胞建立的永生细胞系，其表型为活化的肝星状细胞，具有增殖的特性[4]。目前研究表明，它是进行有关活化的肝星状细胞研究的理想模型。
　　血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）分泌的主要生物活性物质。血管紧张素Ⅱ只有通过与组织细胞膜上的特异性受体结合才能发挥生物效应，主要是血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensinⅡ type 1 receptor, AT1R）。张艺军等[5]应用RT-PCR技术检测分离培养的大鼠肝星状细胞表达血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA，其PCR产物的测序结果与GenBank上AT1R cDNA序列有94%的一致性。Bataller等[6]发现在活化的人类肝星状细胞表面也存在血管紧张素Ⅱ1型受体。这就决定了外源性的血管紧张素Ⅱ可以对肝星状细胞发生作用。
　　目前研究发现，血管紧张素Ⅱ能够促进活化的肝星状细胞的增殖。Bataller等[6]报道，外源性的血管紧张素Ⅱ主要通过L型钙通道，能够剂量依赖性地引起体外培养的人类肝星状细胞内Ca2＋浓度的升高，而细胞内Ca2＋浓度的升高是肝星状细胞活化和增殖必不可少的条件。血管紧张素Ⅱ是活化肝星状细胞的促细胞分裂剂，血管紧张素Ⅱ与血管紧张素Ⅱ1型受体结合，可以促进体外培养活化的人类肝星状细胞的DNA合成和细胞增殖。汪余勤等[7]研究发现血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞的促增殖作用与细胞内Ca2＋浓度的升高密切相关，血管紧张素Ⅱ能够剂量依赖性地促进体外培养的肝星状细胞增殖。张艺军等[8]实验同样发现血管紧张素Ⅱ可以促进肝星状细胞DNA的合成和细胞的增殖。
　　本实验结果表明，血管紧张素Ⅱ能够剂量依赖性地促进HSC-T6肝星状细胞的增殖和细胞DNA的合成，即血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞具有促增殖的作用。

参考文献
[1]  陈非，邓鸿业，邓玉兰，等.  MTT法分析肺泡MØ上清促纤维母细胞生长活性[J]. 免疫学杂志，1993，9(2)：127-130.
[2]  Vermijlen D, Luo D, Robaye B, et al. Pit cells(hepatic natural killer cells) of the rat induced apoptosis in colon carcinoma cells by the perforin/granzyme pathway[J]. Hepatology, 1999, 29(1): 51-56.
[3]  Runge DM, Runge D, Dorko K, et al. Epidermal growth factor and hepatocyte growth factor receptor activity in serum free cultures of human hepatocytes[J].