实时荧光定量RT-PCR检测食管癌survivin mRNA的表达

何晓松1　钱志英1　何流2　周晓明1　戴美红1　张成阳3
（1江苏省肿瘤医院  江苏省肿瘤防治研究所  江苏 南京 210009；
2南京市江宁医院  江苏 南京 211100；3盐城市肿瘤医院  江苏 盐城 224003）

【摘要】 目的  建立实时荧光定量RT-PCR方法检测survivin mRNA的表达。 方法  用Trizol方法提取食管癌组织总RNA后，将其逆转录为cDNA ，建立实时荧光定量RT-PCR 方法，检测人食管癌 survivin mRNA的表达。结果  survivin mRNA在癌组织中高度表达，与正常食管粘膜有显著性差异。 结论 所建立的实时荧光定量RT-PCR方法用于检测检测人食管癌survivin mRNA的表达，是一种快速有效﹑灵敏度高﹑特异性好的定量检测方法。
【关键词】 食管癌  实时荧光定量RT-PCR   survivin mRNA
Detection of surviving mRNA in esophageal cancer by real-time fluorescence quantitative RT-PCR；HE Xiao-song,QIAN Zhi-ying,HE Liu,et al.Department of Oncology，Cancer Institute and Hospital of Jiangsu，Nanjing，Jiangsu，210009 China
【Abstract】  Objective  To establish a real-time fluorescence quantitative RT-PCR.  MethodsTotal RNA was extracted with Trizol from the esophageal carcinoma tissues and mRNA was transcribed reversely into cDNA. The real-time quantitative RT-PCR was used to detect the expression of survivin mRNA. Results  The expression of survivin mRNA in the esophageal carcinoma tissues was significantly higher than that in the normal esophageal tissue. Conclusion  Real-time fluorescence quantitative RT-PCR used to detect the expression of survivin mRNA may be a reliable means for early diagnosis of esophageal carcinoma.
【Key Words】 Esophageal carcinoma; Real-time fluorescence quantitative RT-PCR; Survivin mRNA
 
　　Survivin mRNA 是近年来发现的一种新的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用［1］。Survivin 选择性地表达于胚胎组织和人类大多数肿瘤组织，而在正常人终末分化组织中不表达［2，3］。对survivin 的分子生物学﹑组织分布特征﹑凋亡抑制机制及其于肿瘤的发生发展﹑细胞周期关系的研究已取得了一定进展。本研究拟建立实时荧光定量RT-PCR方法对食管癌组织测定survivin mRNA的表达水平。

1 材料与方法
　　1.1 材料 胃镜下取食管标本52例，其中男性39例，女性13例。经病理组织学诊断：正常黏膜9例，侵润性癌43例。

　　1.2 试剂和仪器 RNA提取试剂盒Teizol Reagant 为Invitrign公司产品，引物﹑荧光探针合成和PCR反应试剂盒由中山医科大学达安基因有限公司提供，ABI Prisnxr 7000荧光定量PCR仪为美国PE公司产品。引物和探针设计参照文献［4］。上游引物序列为：5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′,下游引物序列为：5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探针序列为：5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。

　　1.3 方法 
　　　　1.3.1 RNA提取  通过胃镜下取食道黏膜组织，应用Teizol Reagant试剂盒，按说明书要求提取RNA，同时送病理做出组织学诊断。所提取的总RNA用紫外分光光度计测A280﹑A260定量并检测其纯度。A280／A260≥1.8为合格。所提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28S﹑18S两条区带，证明其完整性。－70℃保存待用。
　　　　1.3.2 cDNA合成  20μl中含：总RNA 1μg，10×缓冲液2μl,dNTPs（10mmol/L）2μl,100ng随机引物，M-MLV(10U/μl)2μl,加DEPC水至20μl。逆转录条件为：37℃ 55 min, 93℃ 3 min。
　　　　1.3.3 荧光定量PCR  50μl反应体系中含：1×定量缓冲液，dNTPs 200μl mol/L,5U ampliTaq Gold,survivin上下游引物各600 nmol/L,荧光探针200 nmol/L,100ng cDNA。反应条件为：50℃ 10s,95℃ 10 min,然后95℃ 15s,60℃ 1min,共42个循环。

　　1.4 统计学处理
　　用SPSS 11.0 For Windows 统计软件进行统计学处理，采用单因素分差分析，P＜0.05有显著性差异。

2 结果
　　2.1 Survivin阳性梯度标准品定量标准曲线制定及Ct值的测定Survivin 定量PCR标准品质粒的构建由中山大学达安基因有限公司完成，所得到的survivin标准品经紫外分光光度计定量，稀释成不同的梯度浓度作为制备标准曲线的模板。以1×10～1×104不同稀释度的标准品DNA模板进行荧光定量PCR扩增。从图1可见，不同起始浓度模板（分别为101﹑102﹑103﹑104﹑105）进入PCR指数增长期的起始点即循环阈值（Cyle threshold,Ct）不同，拷贝数越大Ct值越小。同时也可见不同浓度的模板进入PCR平台期后，PCR产物相差也比较大且不成比例。图2显示不同浓度标准品的Ct值与该标准品浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，Ct值就越小。统计学分析相关系数为1，线性关系极好。根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始mRNA水平。
　　　　　　　
　　2.2 Survivin mRNA 在食管癌及正常食管粘膜中的表达  实时荧光定量RT-PCR检测survivin mRNA结果表明，43例食管癌标本的survivin mRAN表达为4.01±0.54(log copies/mg总RNA),明显高于食管正常粘膜的1.23±0.26。二者比较，P＜0.05，有显著性差异。

3 讨论
　　Survivin在细胞中的生理功能非常主要，涉及到细胞周期的调控﹑细胞凋亡和肿瘤中血管的生成等。研究表明survivin是乞今为止发现的最强的凋亡抑制因子，最新的研究表明survivin抗细胞凋亡存在两种途径，一种是经典的caspases径途，另一种是通过促进细胞分裂而抑制细胞凋亡［5］。与IAP家族不同的是survivin不仅抑制细胞凋亡，还参与对细胞分裂的调控。Survivin的表达具有细胞周期依赖性，在细胞周期的G2/M期选择性地表达。在有丝分裂的开始，survivin与纺锤体的微管蛋白特异性结合，维护有丝分裂的正常进行。干扰survivin和微管蛋白的反应，可导致survivin抗凋亡活性的丧失［6］。血管形成确切地说取决于血管内皮细胞的生存凋亡平衡的结果。已有研究表明survivin参与了血管形成过程，在肿瘤血管增生过程中，血管内
　　皮生长因子（VEGF）与survivin存在正协同作用。VEGF的抗凋亡活性由内皮细胞所表达的survivin介导，而VEGA的存在是survivin作用所必需的条件［7］。研究证明,survivin作为一种新发现的凋亡抑制蛋白，在人类大多数恶性肿瘤中表达，具有强烈的凋亡抑制功能和促细胞增殖活性，并与肿瘤的血管生成和预后有密切的关系。
　　实时荧光定量RT-PCR不仅具有定性PCR的高灵敏度，而且由于荧光探针的应用，通过光电传导系统直接检测PCR扩增过程中荧光信号的变化而获得定量结果。该方法采用完全闭管检测，不需要PCR后处理，避免了交叉污染。具有良好的特异性和较高的灵敏度。该系统对PCR的每一循环进行实时监测，可准确地测定起始模板量的大小。该系统的自动化程度高，每次可对96个样品进行分析。
　　Survivin的高度表达是大多数肿瘤的一个标志，Kato等[8]的研究结果表明survivin在食管癌中的表达明显高于正常组织。本研究也证实了这一点，但我们采取实时荧光定量RT-PCR方法，可更为精确的反映survivin在肿瘤组织中的高度表达。我们期望对survivin在食管癌发生中所起的作用进行进一步的研究，能对食管癌的早期诊断﹑预后判断有所帮助。

参考文献
[1]  Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An anti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspcase-3 and caspcase-7[J].Biochenistry, 2001,40 (4): 1117-1123.
[2]  Satoh K,Kaneko K,Hirota M, et al. Expression of correlated with cancer cell apoptosiss and is involve in the development of human pancreatic duct cell tumors[J].Canaer,2001, 92(2):271-278.
[3]  Sarea AI, Verbeke CS, Ramsdale J, et al. Expression of survivin a novel inhibitor of apoptosiss and cell cycle regulatory protein in pancreatic adenocarcinoma[J].Br J Canaer,2002,86（6）：.886-892.
[4]  Masahide IK, Yasuaki H, Nobuki K, et al. Quantitative analysis of apoptosiss-related gene expression in heaptocellular carcinoma[J].Cancer, 2002,95(9):1938-1945.
[5]  Shankar SI, Mani S, O′Guin KN, et al. Survivin inhibition induces human tumor cell death through caspcase-independent  and-dependent pathways[J].J Nearoche,2001,92(2):426-429.
[6]  Li F, Ackermann EJ, Bennett CF, et al. Pleiotropic cell division defects and apoptois induced by interference with survivin function[J].Nat Cell,1999, 1(8):461-466.
[7]  Mesri M, Morales-Ruiz M, Ackermann EJ, et al. Suppression of vascular endothelial growthfactor-mediated endothelial cell proteition by survivin targeting[J], Am J Pathol,2001,8(4):305-310. 
[8]  Kato J,Kuwabara Y,Mitani M，et al.Expression of survivin in es op hageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy[J].Int J Cancer,2001,95（2）:92-95.