IL-12抗肿瘤肝转移的研究进展

蔡莉（综述）　王娅兰（审校）（重庆医科大学病理教研室　重庆）

　　肝脏是许多恶性肿瘤常见的转移器官之一，单发的转移结节可以积极外科手术治疗，但弥漫性的多发肝转移结节缺乏有效的治疗方法。近几年来免疫治疗、基因治疗为肝转移肿瘤的治疗开辟了新的路径。而白细胞介素12（IL-12）被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，具有明显的抗肿瘤活性,已成为肿瘤免疫治疗及综合治疗中的热点。本文就IL-12的基本特征、抗肿瘤肝转移机制及应用的研究作一综述。

1 IL-12的基本特征  
　　IL-12最早发现于1989年[1]，当时被称为NK细胞刺激因子(natural killer cell stimulatory factor, NKSF)。1990年，由EB病毒转化的另一株B细胞（NC-37细胞系）培养液中发现了一种能诱导细胞毒型淋巴细胞分化成熟的物质，称为细胞毒性淋巴细胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF）。后来的研究证明，NKSF和CLMF的基因序列完全相同，为同一种细胞因子，统一命名为白细胞介素12(interleukin 12,IL-12)。
　　IL-12是由分子量分别为40 KD（p40）和35 KD（p30）的两条肽链经二硫建共价连接而成的异二聚体糖蛋白。由于肽链上糖基化数量的变化，异二聚体的分子量变动于(70~75)×103之间，多数为70×103，故常以IL-12 p70表示IL-12的异二聚体形式。IL-12 p70是IL-12发挥生物学功能的基本分子结构，游离的p40和p30均不表现任何生物活性。产生IL-l2的细胞主要有两大类：一类是参与先天免疫的细胞，如吞噬细胞、浆细胞及角质细胞；另一类是抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，包括吞噬细胞的单核／巨噬细胞、B细胞以及树突状细胞（dendritic cell，DC）和皮肤郎罕细胞。
　　IL-12能显著增强NK细胞和特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic t lymphocyte，CTL）的细胞毒活性；促进T细胞、NK细胞增殖；诱导Thl细胞的分化；刺激T细胞及NK细胞分泌多种细胞因子,特别是IFN-γ,能激活巨噬细胞的溶细胞膜的作用，能诱导干扰素诱导蛋白10(interferon inducible protein 10, IP-10)而发挥抑制肿瘤血管形成的作用，显示出其在肿瘤的免疫治疗中将起重要作用。

2 IL-12抗肿瘤肝转移的机制
　　大量动物实验表明，IL-12不仅能抑制肿瘤的生长，而且能抑制肿瘤的转移，延长荷瘤动物的生存时间，但对IL-l2抗瘤作用在不同肿瘤中的细胞和分子机制各家报道不同。许多研究者发现T细胞是IL-l2抗肿瘤效应的必需物质。Chen 等[2]则认为IL-12的抗瘤作用主要通过CD4+T细胞产生的抗原特异性IFN-γ分泌增加实现。van Herpen  CM等 [3]在用重组人IL-12瘤内注射治疗头颈部鳞癌患者时，发现IL-12的抗瘤效应主要与诱导NK细胞在原发肿瘤内浸润有关。而Xu 等[4]证明IL-l2的抗肿瘤效应需要NK细胞和CD8+T细胞共同参与。除肿瘤的免疫机制外，IL-l2对宿主内皮细胞有直接的抑制血管生成的作用[5]。
　　对于IL-12抗肿瘤肝转移的作用机制，目前也没有统一的结论。Kobayashi  [6]将IL-12注射到不同肿瘤分期（晚期伴肝转移）的RL雄性BALB/c荷瘤小鼠模型中，在肿瘤晚期，裸鼠和胸腺正常小鼠的肝转移均被明显抑制，但IL-12在裸鼠中没产生抗瘤效应。认为IL-12介导的抗瘤效应主要靠T细胞，而抗转移效应主要靠NK和/或自然杀伤性T细胞(natural killer T cells，NKT)细胞, 一种特殊类型的T淋巴细胞，其除表达TCR和CD3等T淋巴细胞特有标记外，同时表达NK细胞系所独有的抗原受体NK1.1、CD56和抑制性受体Ly49)介导。检验IL-12对这些细胞的直接作用，发现IL-12诱导的T细胞增殖在肿瘤早期明显加强，晚期显著下降，但IL-12诱导的被NK和NKT细胞介导的细胞毒活性在早期和晚期均未减弱，T细胞和NK和/或NKT细胞对IL-12的应答性在早期和晚期的不同解释了IL-12在肿瘤晚期显著不足的抗转移效应。Shin T7则证明IL-12激活的Vα14 NKT 细胞而不是NK 细胞的过继性转移阻止了B16黑素瘤的肝转移，同时NK细胞在IL-12介导的抗瘤效应中发挥的作用很小。在Vα14 NKT细胞介导的抗瘤活性的效应期,直接的细胞毒机制胜于细胞因子介导的免疫反应。但Park 等[8]对NKT细胞是IL-12介导的肿瘤排斥反应系统的必需细胞的观点提出了挑战，认为IL-12介导的肿瘤排斥反应机制复杂，与不同肿瘤所处的特定微环境有关。他们检测和对比了经外源性IL-12给药后NKT细胞、T细胞、NK细胞和其他γ-链依赖的非T非B细胞对小鼠B16黑色素瘤细胞的排斥作用，结果不支持NKT细胞在IL-12介导的肿瘤排斥反应中的必要作用，却证实了NK细胞介导了肝转移的排斥反应，这与肝脏内NK细胞的高频率分布及其功能是一致的。
　　近几年来，用重组腺病毒载体将IL-12基因转移到肝细胞已被证明在小鼠中能抑制原发性和转移性肝脏肿瘤，但抑制机制不明确。有研究[9]认为携带IL-12基因的腺病毒（adenovirus encoding IL-12,AdIL-12）抗肝转移的抗瘤活性不依赖T细胞、NK细胞及NKT细胞，但在Miller等 [10]的实验中，经AdIL-12治疗的NK细胞失活的小鼠血清IL-12水平比NK细胞正常的小鼠升高了250倍,转基因表达延长了接近两周。分离这些经AdIL-12治疗后动物的NK细胞，发现它们以溶解活性和IFN-γ分泌的方式被激活。将这种NK细胞过继性转移到未接受过治疗的荷瘤小鼠身上，也明显抑制了结肠直肠癌的肝转移。表明AdIL-12抑制结肠直肠癌的肝转移除了部分通过NK细胞产生的IFN-γ介导外，内生性IL-12的过度表达激活NK细胞亦参与了抗转移过程。

3 IL-12抗肿瘤肝转移的应用
　　IL-12在多种临床前期动物模型中都表现出了抗肿瘤作用，但在体内使用IL-12有较大毒性反应。而用IL-12基因工程疫苗治疗肝转移毒副作用较小，成为目前研究的热点，根据IL-12免疫基因治疗的给药途径和方法主要分为体内基因治疗、原位基因治疗和离体基因治疗：
　　3.1 体内基因治疗 
　　体内基因治疗是将目的基因载体注射到血液系统进行全身性基因治疗。病毒载体传递法是最有效的传递重组基因至体细胞的方法之一。目前最常用的载体为重组逆转录病毒和重组腺病毒。
　　　　3.1.1 重组逆转录病毒   Alves 等 [11] 用单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK) 或更昔洛韦 (GCV)联合携带IL-12基因的逆转录病毒治疗大鼠DHDK12 结肠癌的多灶性肝转移模型,不仅观察到肿瘤体积明显缩小,而且大鼠存活率显著提高。在部分肝切除术后显微镜下有DHDK12复发的大鼠模型中，经逆转录病毒介导的IL-12基因治疗后,再发肿瘤体积显著缩小，生存率也明显提高。这说明IL-12作为基因治疗的佐剂有助于可切除或不可切除患者的治疗。
　　　　3.1.2 重组腺病毒  有研究表明通过AdIL-12和抗-4-1BB的联合治疗可以根除小鼠结肠癌的肝转移，但此疗法对肿瘤面积大于8 mm× 8 mm的小鼠疗效不佳。Pan等  [12]证明了活体内OX40与 CD4+T 细胞的结合诱导了在经AdIL-12、抗-4-1BB和抗-OX40联合治疗的大瘤负荷小鼠身上更高的CTL反应。该联合治疗得到的小鼠存活率比仅用AdIL-12与抗-4-1BB联合治疗的高，其长期存活的小鼠显示了更高的对抗亲代肿瘤的记忆性CTL反应。因此，用AdIL-12+抗-4-1BB+抗-OX40的联合治疗可能为与免疫抑制或耐受有关的晚期癌症患者提供了一个更好的治疗模式。
　　　　许多临床前试验表明低剂量的IL-12使CTL反应成为可能，但高剂量的人IL-12的重组体(recombinant human IL-12 ，rhIL-12)有明显的毒力。Cebon 等[13]寻找并测定了rhIL-12与抗原肽联合治疗在更低剂量时的最佳生物剂量：在受试者为通过RT-PCR 或免疫组织化学表达黑素-A(Melan-A)来评价的III 或 IV期黑素瘤患者中，以10~100 ng/kg的剂量经皮下或静脉注射的rhIL-12能被耐受。但近年来更多研究倾向于IL-12基因疫苗在肿瘤的局部应用。
　　3.2 原位基因治疗  原位基因治疗是将目的基因载体直接注射或导入体内的肿瘤组织，进行局部性基因治疗。它因在增强局部肿瘤免疫反应使肿瘤消退的同时不会导致循环中高浓度IL-12而优于全身用药。Jarnagin [14]用直接瘤内注射NV1042（一种有溶瘤细胞活性的载有IL-12基因的单纯疱疹病毒复制品）的方法治疗所建立的肿瘤模型，不仅使母瘤体积缩小，而且明显降低了母瘤切除术后肝再发肿瘤的数量和再次给药量。Gao等[15]将携带IL-12编码的纤维-突变体腺病毒载体（IL-12-encoding fiber-mutant adenoviral vector ，AdRGD-IL-12）单次小剂量（2× 107 空斑形成单位）注射入Meth-A纤维肉瘤（对IL-12的全身用药不敏感）小鼠的瘤内，诱导了明显的抗瘤活性，并使该荷瘤小鼠的生存率显著延长。免疫组织化学染色表明AdRGD-IL-12诱导了瘤组织内T细胞的聚集，且病毒载体瘤内给药诱导的抗转移效应与对抗同源肿瘤长期的特异性免疫一样好。
　　3.3 离体基因治疗 
　　立体基因治疗是将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞，免疫细胞或其他细胞，再将这些修饰过的靶细胞转入体内。
　　DC是目前发现的功能最强大的APC，也是分泌IL-12的细胞之一。由DC激活的细胞免疫，特别是CTL介导的免疫反应，在机体抵御恶性肿瘤中发挥着十分重要的作用。Satoh等 [16]直接将IL-12 基因转染的DC注入门静脉明显抑制了C57BL/6小鼠模型MC38结肠癌在肝脏的生长，并伴有CD4+、CD8+和NLDC-145+免疫效应细胞的瘤内蓄积，还导致了全身免疫反应，这种反应是由从脾和引流淋巴结分离的T淋巴细胞引起的IFN-γ分泌增强诱导的。对Cy3-标记的DC随门静脉灌注归巢的评价证实了他们在肝脏和淋巴组织的分布。所以IL-12 基因转染的DC的局部给药不仅能在活体内抑制结肠直肠癌在肝脏的生长，而且能激发全身性抗瘤免疫反应。这条途径很可能提高结肠直肠癌转移的免疫治疗效果,因为肿瘤相关DC的数量与更好的预后成正相关。同时局部基因治疗将进一步提高临床功效,使患者不用冒全身中毒的危险。
　　为获得IL-12在肿瘤部位的局部表达而