四军医大构建HBV全基因克隆质粒细胞系

    第四军医大学流行病学教研室主任闫永平教授等应用分子生物学克隆技术，在国内首次成功构建体外HBV全基因克隆质粒pcDNA3-3HBV细胞系。据介绍，由于乙肝病毒（HBV）宿主范围窄，动物模型缺乏，迄今用于繁殖HBV的所有组织培养系统，都是用串联的HBV基因组，因而制约了对HBV的深入研究。将HBVDNA转移至靶细胞，建立表达HBV的体外培养细胞模型，是当前研究HBV生物学特性及其发病机制的一种新思路。对此，闫永平等研究人员采用克隆技术，将以3倍HBV基因的重组真核表达质粒，通过体外培养分离、细胞转染、抗原表达及检测鉴定等一系列技术处理后，从而成功地克隆出一种全新的HBV全基因组克隆转染细胞系“pcDNA3-3HBV”。

    该细胞系检测结果显示，4周“pcDNA3-3HBV”即稳定转染人肝母细胞瘤细胞系（HepG2）靶细胞，阳性克隆形成；培养上清HBsAg及HBeAg呈阳性，细胞内HBcAg呈核浆型分布；扩增可见HBVS基因mR鄄NA表达；上清中HBV特异性前S/S基因阳性，HBV滴度48小时为1×108拷贝/升。提示构建的HBV全基因细胞系在转录、复制及特异性表达方面良好，能产生较高水平的HBV。

    研究人员认为，HBV基因组呈双链闭合环状，基因结构紧凑，其开放读框分布于全长DNA。用其构建的“pcDNA3-3HBV”含有完整的头尾串联的HBV全基因，载体pcD-NA3带有CMV早期启动增强子，转染细胞可分泌结构完整的病毒颗粒。同时，其优点还在于病毒复制可持续时间长，且能传代培养。目前在该领域水平上，国外仅利用转染细胞的培养上清感染细胞研究HBV的感染机制，而我国已利用阳性血清成功感染Hep×G2细胞和原代培养的滋养层细胞，并将其分泌的HBV建成接近自然状态。这个HBV全基因克隆细胞系，为我国HBV感染机制及胎盘滋养层细胞特异性受体的后续研究奠定了坚实基础并带来广阔的应用前景。